Biosensori, veicoli e bioreattori cellulari

IL Sottoprogetto 4 era articolato in tre temi: Biosensori, Veicoli e Bioreattori Cellulari, Utilizzazione di Membrane Biologiche ed Artificiali, attorno ai quali si erano aggregati rispettivamente 5, 7 e 9 gruppi di ricerca. I tre temi sono tuttora di grande attualità in campo biotecnologico, grazie al loro rilevante potenziale applicativo.

Biosensore elettrochimico per glucosio realizzato con la tecnica del Silicio

I biosensori sono dispositivi bioelettronici nei quali un componente biologico, in grado di riconoscere selettivamente una data specie molecolare, è accoppiato ad un trasduttore, capace di trasformare il segnale chimico dell'interazione in un segnale fisico, solitamente elettrico. I biosensori hanno avuto importanti applicazioni in biomedicina, in zootecnia, in agricoltura, nel rilevamento dell'inquinamento industriale, nel controllo delle fermentazioni ecc. Il lavoro dei gruppi del Sottoprogetto impegnati sul tema Biosensori è stato rivolto allo sviluppo di modelli, prototipi e processi di preparazione di biosensori adatti all'impianto in vivo per il rilevamento di parametri ematici e tissutali. Queste ricerche hanno portato alla realizzazione di un monitor continuo per il glucosio, che sfrutta il principio della microdialisi mediata da una fibra cava, con una relazione lineare tra il segnale di corrente e la concentrazione di glucosio. È stato realizzato anche un sensore ad ureasi per la rilevazione in flusso dell'urea, utilizzabile sui pazienti dializzati mediante rene artificiale. È stato, inoltre, messo a punto un sensore enzimatico capace di operare anche in soluzione non acquosa, in grado di determinare i fenoli contenuti nelle acque di vegetazione di frantoio, che costituiscono un problema ambientale di notevole rilievo. Sempre sul tema dei Biosensori, sono stati sviluppati due nuovi tipi di sensori utilizzanti ammino ossidasi, che permettono la misura delle poliammine nell'intervallo di concentrazione mM-nM e, quindi, potenzialmente in grado di misurare direttamente tali molecole nei fluidi biologici.

La possibilità di utilizzare particolari tipi di cellule come vettori per il trasporto nell'organismo di tutta una serie di principi biologicamente attivi (farmaci, proteine, bioregolatori ecc.) ricorre da tempo come ipotesi di terapia in diverse malattie congenite o acquisite. Più recentemente, è stato introdotto anche l'uso di cellule come bioreattori, intesi come cellule modificate in modo da fornire funzioni biologiche attive, quali ad esempio attività enzimatiche mancanti in individui affetti da difetti ereditari, detossificazioni, ecc. Le ricerche sul tema dei Veicoli e Bioreattori Cellulari sono state indirizzate alla caratterizzazione ed utilizzazione di eritrociti e di altre cellule come veicoli di farmaci e come bioreattori circolanti per applicazioni in medicina umana e veterinaria. I risultati ottenuti sono stati interessanti anche da un punto di vista applicativo ed in qualche caso hanno permesso la sperimentazione clinica preliminare del prodotto. Molto lavoro è stato dedicato all'impiego di eritrociti umani come veicolo di farmaci antineoplastici. È stata eseguita una ricerca clinica allo scopo di valutare la distribuzione dei vettori nell'organismo di pazienti affetti da carcinoma epatico, dopo infusione endovenosa sistemica di eritrociti autologhi trattati con glutaraldeide, allo scopo di indurre un tropismo epatico. È stata studiata anche la possibilità di usare gli eritrociti come vettori di antigeni di interesse immunoprofilattico. Gli antigeni prescelti per questo tipo di studi sono stati la proteina gp120 di HIV (che è stata legata all'esterno degli eritrociti mediante due procedimenti alternativi) ed i tossoidi della pertosse, della difterite e del tetano, intrappolati all'interno degli eritrociti. È stato poi dimostrato che l'incorporazione nei globuli rossi di inositolo esafosfato (IHP) un potente effettore allosterico dell'emoglobina determina un aumento della P50, corrispondente ad una diminuzione dell'affinità dell'emoglobina per l'O2. Esperimenti in vivo hanno dimostrato che la trasfusione di queste emazie caricate con IHP determina un aumento dell'estrazione di ossigeno del 36%. I globuli rossi sono stati caricati anche con farmaci antiretrovirali ed indirizzati specificamente sui linfociti T e macrofagi, allo scopo di combattere infezioni da virus linfotropici. Il sistema di targeting macrofagico, quando utilizzato con eritrociti portatori di ddCTP, si è dimostrato capace di inibire la produzione di HIV in vitro e di evitare la comparsa dei sintomi tipici dell'immunodeficienza in un modello murino di AIDS. È stata, inoltre, studiata la rimozione fagocitaria di globuli rossi alterati dall'infezione malarica. Si è riscontrato che una particolare modificazione dell'emoglobina da parte dei plasmodi (pigmento malarico) non è digeribile da parte del macrofago, che è incapace di catabolizzarlo. Tale pigmento è un generatore di radicali, che ledono irreversibilmente il macrofago, rendendolo incapace di fagocitare. È stata, infine, studiata la possibilità dell'impiego, in immunoterapia adottiva, di cellule citotossiche caricate con farmaci antineoplastici.

Globuli rossi

Nell'ambito del tema sulle Membrane Biologiche ed Artificiali, il lavoro è stato rivolto alla costruzione e caratterizzazione di strutture membranarie per il trasporto e la liberazione controllata nell'organismo di farmaci bioregolatori. I liposomi sono vescicole formate da membrane lipidiche naturali o sintetiche, utilizzate da tempo come contenitori protettivi. Sono metabolizzabili intracellularmente e sono inerti rispetto all'azione farmacologica del composto veicolato. L'inserimento nella membrana lipidica di particolari molecole può conferire ai liposomi la capacità di riconoscere specificamente le cellule bersaglio del farmaco veicolato. I singoli gruppi impegnati in questo tema hanno adottato diversi approcci. I liposomi sono stati utilizzati per il trasporto della citocromo ossidasi di mammifero: si è osservato che l'enzima inserito in piccole vescicole unilamellari (SUV) ha proprietà cinetiche e funzionali del tutto simili a quelle proprie dell'enzima purificato ed è in grado di formare il gradiente elettrochimico protonico che ne modula l'attività. È stato investigato l'uso di tossine animali per favorire l'interazione di liposomi con cellule o tessuti bersaglio. In particolare, sono state studiate due proteine con attività miotossica, purificate dal veleno di serpente, la miotossina II da Bothrops asper e la ammoditina L da Vipera ammodytes. I dati ottenuti hanno dimostrato che le due tossine sono in grado di causare un massiccio rilascio del contenuto acquoso dei liposomi e la loro successiva fusione attraverso un meccanismo calcio-dipendente. Sono state anche evidenziate le interessanti proprietà di tropismo cerebrale dei liposomi contenenti solfatidi. Questi liposomi si sono anche dimostrati capaci di rilasciare nel siero i marcatori lipoincapsulati in modo differenziato, in funzione delle variazioni del pH nel sangue. Un leggero stato di acidosi promuove, infatti, un efficiente rilascio del contenuto intraliposomale nel siero. È stata esplorata anche la possibilità di realizzare microcapsule biocompatibili, contenenti insule pancreatiche umane o animali, in grado di rilasciare insulina in risposta a stimoli fisiologici.