LA RIVOLUZIONE GENETICA
di Piero Benedetti
Ricercatore presso L' Istituto di Biologia Cellulare del CNR, Roma

Le Topoisomerasi per i farmaci antitumorali

Il DNA non è una struttura statica, ma è libera di muoversi nello spazio fluido della cellula, assumendo varie conformazioni topologiche (da topos = spazio), come annodarsi e avvolgersi su se stesso; inoltre, tutti i processi cellulari che comportano uno scorrimento di complessi proteici sul DNA alterano la sua struttura nello spazio, torcendolo, srotolandolo e creando delle regioni di super avvolgimento del tutto simili a quelli che può assumere una corda od un elastico. Questa struttura del DNA nello spazio viene controllata e regolata da una serie di enzimi che si chiamano DNA Topoisomerasi.

Struttura cristallografica di un frammento della DNA Topoisomerasi II.

Esistono due classi di questi enzimi, definite in base al loro meccanismo d'azione. Gli enzimi di classe I sono costituiti generalmente da un monomero e sono capaci di introdurre una rottura su un singolo filamento della doppia elica del DNA, rilassando il DNA di un giro alla volta. La reazione non richiede un apporto di energia sotto forma di ATP.

Gli enzimi di classe II sono costituiti da due o più subunità e sono capaci di introdurre tagli su entrambi i filamenti della doppia elica del DNA per srotolarlo. In questo caso la reazione procede solo in presenza di ATP.

Ogni reazione di topoisomerizazzione, sia essa dovuta ad enzimi di classe I o classe II, può essere divisa in tre momenti. Il primo consiste nella rottura del filamento o dei filamenti e nella formazione di un legame covalente tra l'enzima e il DNA. Il secondo consiste nel passaggio del filamento o dei filamenti intatti attraverso il sito di rottura. Nel terzo ed ultimo momento avviene la saldatura covalente dei filamenti precedentemente tagliati. L'energia necessaria a ricostituire la catena polinucleotidica intatta è conservata nel legame tra l'enzima ed il filamento interrotto e negli enzimi di tipo II, che richedono ATP come fattore energetico, questa molecola viene usata come induttore di grossi cambi conformazionali. Negli ultimi anni la ricerca sulle Topoisomerasi ha avuto un enorme sviluppo grazie a studi di cristallografia, che hanno contribuito in maniera essenziale alla verifica dei modelli proposti per il loro meccanismo di azione; tuttavia è stata risolta la struttura cristallografica solo di alcuni frammenti proteici di questi enzimi e probabilmente questo è dovuto alla loro complessità e flessibilità che rende difficile la cristallizzazione dell'enzima intero. Nel caso della Topoisomerasi II di lievito, il frammento cristallizzato rappresenta la parte che contiene il sito attivo e inoltre è visibile la sua forma a tenaglia. Questo enzima infatti funziona come una vera e propria tenaglia che intrappola il DNA al suo interno aprendosi nella parte superiore, poi permette il passaggio di un'altra regione di DNA a doppio filamento nell'apertura prodotta. Alla fine della reazione la parte inferiore dell'enzima si apre come un cancello e il filamento trasportato attraverso la tenaglia può uscire. Questa serie complessa di reazioni viene provocata da cambi conformazionali dovuti alla molecola di ATP che si lega nella parte N terminale dell'enzima. Il nostro laboratorio ha contribuito alla comprensione del meccanismo di azione della Topoisomerasi II con studi di microscopia elettronica ad alta risoluzione. Con l'osservazione dell'enzima intero e dei frammenti parziali di cui si conosceva la struttura cristallografica, siamo riusciti a "fotografare" l'enzima nelle varie fasi della sua azione catalitica. Le Topoisomerasi hanno assunto un'importanza primaria nella ricerca oncologica perché molti farmaci antitumorali hanno come target specifico questi enzimi e, quindi, lo sviluppo di farmaci più efficienti, che superino la farmaco resistenza, è uno degli obiettivi primari della ricerca oncologica e biotecnologica. Nei nostri progetti di ricerca ci siamo occupati estensivamente di comprendere, a livello molecolare, la resistenza al farmaco antitumorale camptotecina, che agisce specificamente sulla Topoisomerasi I umana e che è attualmente in uso in terapia clinica.

La Topoisomerasi I legata al DNA.

Abbiamo usato nel nostro lavoro il lievito Saccharomyces cerevisiae come sistema modello e questo microrganismo si è rivelato molto utile per lo studio della farmaco resistenza. E’ possibile infatti sia fare screening molto ampi di diverse sostanze antitumorali, sia isolare mutanti che rivelino caratteristiche interessanti per l'interazione con farmaci diversi, come per esempio mutanti resistenti. Abbiamo infatti isolato un gran numero di mutanti resistenti alla camptotecina e ne abbiamo individuato le sostituzioni aminoacidiche e, inoltre, abbiamo caratterizzato il loro comportamento a livello biochimico. Questo lavoro ci ha permesso di formulare un modello che illustra come questo farmaco interagisce con l'enzima e il DNA e questo modello sarà certamente utile per disegnare nuovi farmaci. La regione che interagisce con il farmaco è contenuta in un loop che contiene le mutazioni responsabili della resistenza (colore rosa) e il DNA interagisce con questa stessa regione.