LA RIVOLUZIONE GENETICA
di Antonio De Flora
Direttore del Progetto Finalizzato "Biotecnologie" del CNR Genova

Globuli rossi ingegnerizzati: nuovi farmaci biotecnologici per la terapia

LA SCHEDA TESTIMONIANZA Di Sergio Donpè Presidente dell'industria DONPE'

Nel nostro sistema circolatorio sono presenti da 20.000 a 25.000 miliardi di globuli rossi (eritrociti), ciascuno dei quali vive in media quattro mesi prima di terminare la sua vita nella milza. Il compito primario degli eritrociti è quello di trasportare ossigeno (O₂) dai polmoni ai tessuti e anidride carbonica (CO₂) dai tessuti ai polmoni. Per dare una dimensione approssimativa di questa "professione", un singolo eritrocita contiene circa 300 milioni di molecole della proteina respiratoria emoglobina. Ciascun globulo rosso è in grado di legare labilmente 1.200 milioni di molecole di O₂ a livello degli alveoli polmonari e di cederne circa 600 milioni (aumentabili o diminuibili, a seconda delle esigenze) ogni volta che esso transita nei capillari a livello dei tessuti. Di conseguenza, ad ogni giro di circolazione tutti gli eritrociti "scaricano" nei tessuti 12-15 x 10^2l molecole di O₂, grazie alle quali i tessuti stessi possono respirare e vivere normalmente.

Morfologia dei globuli rossi dopo il procedimento di incapsulazione

Da questa premessa sembrerebbe impossibile pensare che gli eritrociti possano svolgere funzioni diverse da quelle del trasporto di gas respiratori. In realtà, funzioni aggiuntive e completamente nuove possono essere acquisite mediante trattamenti semplici, alla portata di laboratori non particolarmente attrezzati e tali da non compromettere la sopravvivenza residua degli eritrociti una volta che questi siano nuovamente somministrati allo stesso soggetto o ad un soggetto immunocompatibile.

Il principio è semplice. Eritrociti prelevati e trattati sterilmente da un qualsiasi donatore (animale o uomo) vengono sottoposti ad uno "shock ipotonico" transitorio in presenza di una sostanza che si desidera "intrappolare" negli eritrociti stessi. Lo shock crea dei pori reversibili nella membrana eritrocitaria, grazie a particolari caratteristiche di elasticità della stessa. Le dimensioni dei pori sono sufficientemente grandi da permettere il passaggio di grandi molecole (fino 200-300 kDa, quindi, ad esempio, anche proteine), così che molecole poste a contatto con gli eritrociti durante o subito dopo il trattamento di "shock" possono penetrare negli stessi. A questo punto, gli eritrociti vengono sottoposti a "risigillamento" isotonico, che occlude i pori, per cui la sostanza internalizzata (o incapsulata, come si dice in gergo) rimane all'interno dei globuli rossi.

La fase successiva è quella del controllo di qualità degli eritrociti così trattati prima che essi siano risomministrati in vivo per la stessa via endovenosa attraverso la quale sono stati prelevati. In ogni caso, il trattamento descritto (shock ipotonico-risigillamento isotonico) non compromette di per sé né le proprietà morfologiche, biochimiche immunologiche degli eritrociti, né la loro sopravvivenza in circolo, a meno naturalmente che la molecola intrappolata non sia eritrotossica.

Le nuove funzioni cui si accennava in precedenza dipendono appunto dal tipo di molecole intrappolate negli eritrociti. Ad esempio, se la molecola è un farmaco membrana-diffusibile, l'eritrocita funzionerà come un sistema di rilascio dello stesso. In tal caso potremo avere, in seguito a reinfusione allo stesso soggetto, eritrociti carriers o trasportatori di farmaci particolarmente citotossici (ad esempio, farmaci antitumorali e antivirali) o, in altemativa, di farmaci particolarmente instabili che saranno quindi protetti dalla schermatura entro gli eritrociti. Se, viceversa, la molecola incapsulata è un enzima, anche se estraneo al globulo rosso, questo potrà catalizzare reazioni inusuali trasformando pertanto l'eritrocita così trattato in un "bioreattore" circolante idoneo a compiere nuove funzioni.

La Tabella mostra un elenco di sostanze che sono già state intrappolate con successo in eritrociti di vari mammiferi (topi, ratti, pecore, maiali, bovini, cani) e anche umani, per varie applicazioni farmacologiche o di prevenzione di malattie. Di particolare interesse, oltre alla costruzione ed all'impiego di globuli rossi caricati con farmaci antitumorali che permettono di migliorare considerevolmente le proprietà farmacocinetiche di tali molecole, è la possibilità di incapsulare antigeni d'interesse vaccinale. Infatti, si utilizza il particolare tropismo degli eritrociti verso i macrofagi della milza (dove, una volta invecchiati, essi sono destinati a morire), che sono cellule professionalmente deputate all'elaborazione dei diversi antigeni con conseguente attivazione della risposta immunitaria e innesco di quei complessi eventi che culminano nella produzione di anticorpi diretti contro quegli antigeni. In altri termini, gli eritrociti, come da noi dimostrato, svolgono una doppia funzione di trasportatori e di "adiuvanti", prestandosi così alla formulazione di nuovi vaccini, anche se questi sono da riservare solo a casi di prevenzione di malattie letali (tumori, AIDS, etc.).

Cromosomi umani ingranditi 40.000 volte con un microscopio elettronico a scansione.

All'elenco riportato nella Tabella occorre aggiungere alcuni profarmaci, cioè molecole capaci di generare in vivo sostanze farmacologicamente attive dopo opportune reazioni di bioconversione. L'intrappolamento di profarmaci configura, più che una passiva funzione di trasportatore, proprietà attive e "intelligenti" degli eritrociti così trattati. In effetti, si può considerare questa strategia come un sistema completamente innovativo per la formulazione di farmaci, la cui validità è stata collaudata in diversi Istituti tra cui l'Istituto di Chimica Biologica dell'Università di Genova e l'Istituto di Chimica Biologica "Giorgio Fornaini" dell'Università di Urbino. La strategia, che si può semplicisticamente definire in termini di costruzione di eritrociti capaci di funzionare come piccole fabbriche cellulari circolanti per la formazione e il rilascio di farmaci, pone in effetti alcuni problemi che vanno risolti caso per caso. Ad esempio, occorre progettare e sintetizzare molecole di profarmaci che non solo siano idonee all'intrappolamento (e che quindi non vengano rapidamente estruse dagli eritrociti), ma che vengano anche riconosciute come substrati di enzimi eritrocitari capaci di operare quelle reazioni di bioconversione che devono portare alla formazione ed al successivo rilascio del farmaco da disseminare in circolo. Occorrono pertanto competenze largamente interdisciplinari di chimica di sintesi, chimica analitica, biochimica, farmacologia che, unite a quelle dei clinici, possano portare all'impiego terapeutico di questi sistemi. Le reazioni successive di bioconversione intraeritrocitarie possono anche essere numerose, configurando vere e proprie sequenze multienzimatiche a partire da determinati profarmaci, la cui utilità può essere suggerita dall'opportunità di realizzare in vivo farmaci molto potenti e dotati di proprietà farmacocinetiche particolarmente vantaggiose. Ancora una volta ciò si verifica soprattutto per farmaci chemioterapici di per sé molto tossici, la cui generazione intraeritrocitaria ed il successivo rilascio devono avvenire secondo cinetiche lente.

Schema del procedimento di shock ipotonico-risigillamento isotonico per intrappolare sostanze chimiche nei globuli rossi

Sempre a proposito di eritrociti ingegnerizzati come "bioreattori", ho in precedenza menzionato l'intrappolamento di enzimi estranei ai globuli rossi che, operando nell'ambiente intraeritrocitario, sono in grado di catalizzare reazioni di bioconversione molto utili. Esempi di tali potenzialità sono alcuni enzimi capaci di detossificare l'organismo da veleni vari (ad esempio, alcool etilico, ma anche sostanze ben più pericolose come il cianuro) e l'asparaginasi, un enzima usato nella terapia di alcuni linfomi e leucemie linfoidi acute, il cui impiego è suggerito dalla necessità di abbassare i livelli circolanti di asparagina che sostiene la proliferazione delle cellule linfoblastoidi. Questo ultimo tipo di trattamento, giustificato dal fatto che l'asparaginasi (enzima eterologo purificato da microrganismi del genere Aspergillus) può determinare episodi anafilattici anche mortali, ha in effetti dimostrato la validità e l'innocuità dell'asparaginasi intrappolata negli eritrociti dei pazienti, in una serie di prove cliniche svolte sia negli Stati Uniti che in Francia.

Fino a questo punto sono state considerate le nuove funzioni acquisite dagli eritrociti "aperti e richiusi" nell'ambito del circolo sanguigno in generale. In effetti l'ubiquità degli eritrociti, oltre che la loro biodegradabilità e compatibilità, rende ragione del lavoro "a tutto campo" (cioè in qualsiasi distretto dell'organismo) degli eritrociti ingegnerizzati. In realtà, in alcune situazioni, sarebbe quanto mai opportuno disporre delle stesse prestazioni da parte dei globuli rossi, ma esclusivamente in alcune sedi ben definite. In altri termini, occorrerebbe un targeting preciso di bersaglio cellulare, o di tessuto o di organo, tale da evitare effetti collaterali non desiderati a livello di distretti aspecifici.

La realizzazione di un targeting selettivo da parte di eritrociti ingegnerizzati è un obiettivo purtroppo ancora remoto, se si pensa a parenchimi come fegato, cuore, reni, sistema nervoso centrale e periferico. La barriera endoteliale dei vasi sanguigni è un ostacolo finora insuperabile per poter indirizzare selettivamente eritrociti modificati (ad esempio mediante anticorpi monoclonali specifici anti-tessuto) ai distretti desiderati. Risultano quindi indispensabili ulteriori, approfondite ricerche sui sistemi di riconoscimento tra eritrociti e cellule endoteliali di diversi distretti prima di poter pensare concretamente ad una selettività di bersaglio.

Sia pure con queste limitazioni, recentemente ricerche italiane, promosse nell'ambito del Progetto Finalizzato CNR "Biotecnologie e Biostrumentazione", hanno portato ad un importante e selettivo effetto di targeting degli eritrociti ingegnerizzati ai macrofagi. Tali ricerche effettuate presso l'Istituto di Chimica Biologica "Giorgio Fornaini" dell'Università di Urbino sono state rese possibili da alcuni studi svolti in precedenza presso l'Istituto di Biologia, Genetica e Chimica dell'Università di Torino. Il principio, ancora una volta, è relativamente semplice: gli eritrociti, già caricati con opportuni farmaci, vengono ulteriormente ingegnerizzati mediante un trattamento che ne rende possibile il rapido riconoscimento e la successiva fagocitosi (internalizzazione) da parte delle cellule macrofagiche. A questo punto, l'eritrocita inglobato dal macrofago rilascia in questa cellula il proprio contenuto. Attraverso questa ingegnosa strategia, i ricercatori dell'Università di Urbino (Mauro Magnani e Collaboratori), hanno usato eritrociti caricati con farmaci anti-HIV come un vero e proprio "cavallo di Troia" per colpire il retrovirus con cui erano stati in precedenza infettati i macrofagi, sia in vitro che in vivo, in un modello sperimentale murino di AIDS e nella malattia corrispondente dei felini infettati da FIV. I risultati sono stati eccellenti e di particolare utilità si sono dimostrate la somministrazione combinata di ddCTP (la forma attiva di un classico farmaco antiretrovirale) intrappolato negli eritrociti e quella di farmaci antiretrovirali per via convenzionale. In effetti, il sistema basato sugli eritrociti trasportatori va a colpire elettivamente i macrofagi (che funzionano notoriamente da "nascondiglio" in cui si annida HIV prima di arrivare all'infezione conclamata), mentre la somministrazione per via convenzionale (orale o endovenosa) di farmaci antiretrovirali colpisce prevalentemente i linfociti.

Il sistema ideato da Magnani e Collaboratori era suscettibile di perfezionamento, poiché la molecola che perviene al macrofago infettato via eritrociti (ddCTP) risulta piuttosto tossica per il macrofago stesso. In particolare, era necessario far pervenire al macrofago una molecola analoga, già fosforilata, ma non così estesamente (ben tre volte) da determinare effetti tossici. Ricerche svolte in collaborazione tra il nostro Istituto (Umberto Benatti e Collaboratori) e quello dell'Università di Urbino hanno portato a progettare una nuova molecola idonea allo scopo. Tale molecola rappresenta il perfezionamento della nota Azidotimidina (AZT), il farmaco anti-HIV più utilizzato nella terapia dell'AIDS, che peraltro risulta dotato di notevole tossicità e, somministrato come tale, non colpisce i macrofagi ma molti altri comparti cellulari, tra cui i linfociti. La nuova molecola, da noi brevettata, ha la struttura costituita da una doppia AZT in cui è stato deliberatamente introdotto un legame pirofosforico tra le due identiche parti di AZT. La scelta di questo legame è stata dettata da studi di enzimologia che ci avevano dimostrato una scarsa suscettibilità del legame stesso ad essere scisso da enzimi eritrocitari e, quindi, l'idoneità di una tale molecola ad essere trasportata come tale ai macrofagi. Una volta raggiunti i macrofagi, mediante gli eritrociti con essa caricati, la molecola in questione può essere smontata da un enzima che genera un'AZT monofosforilata, non tossica e capace di trasformarsi efficientemente e senza pericolo per il macrofago nella specie farmacologicamente attiva AZT trifosfato.

Il sistema ha dimostrato di poter funzionare molto efficacemente in vitro in macrofagi infettati sia da HIV, sia da FIV, sia da un retrovirus responsabile del modello murino di AIDS. In particolare si è riscontrato, con metodologie di biologia molecolare, un blocco quasi completo dell'infezione da ciascuno dei tre retrovirus. In vivo, nel modello murino, sono state effettuate prove preliminari che hanno dimostrato un buon sinergismo tra trattamento mediante eritrociti e trattamento convenzionale con AZT nell'inibizione della proliferazione del virus nel cervello. Se ulteriormente confermati, questi studi potrebbero fornire un sistema di targeting al sistema nervoso centrale, con relativa protezione nei confronti dell'infezione retrovirale in questa sede elettiva.

Il procedimento di sintesi della molecola è molto versatile ed è stato da noi già utilizzato per costruire altre molecole derivanti dalla combinazione di due diversi farmaci convenzionali anti-HlV o anche di farmaci anti-HIV ed antitubercolari. La strategia generale di questa serie di ricerche permette quindi di prospettare il targeting selettivo ai macrofagi di molecole chemioterapiche "ibride" e come tali capaci di proteggere i macrofagi stessi da diversi agenti patogeni (HIV, altri virus micobatteri). Come ricordato, si tratta di realizzare nuovi tipi di formulazione di farmaci e profarmaci in cui ad un approccio chimico si affianca una strategia biologica basata su meccanismi di bioconversione, su processi di bioriconoscimento e su processi d'interazione tra cellule. Come tali, queste ricerche potrebbero aprire la strada alla costruzione di cellule diverse dagli eritrociti per realizzare trasportatori e bioreattori aventi performances terapeutiche migliori rispetto a quelle di farmaci tradizionali.