ricerca&societā

istituti:		GENETICA E BIOFISICA
MICHELE D'URSO Dirigente di ricerca presso 'Istituto Internazionale di Genetica e Biofisica del CNR, Napoli
TIZIANA BARDARO Ricercatore presso lo stesso Istituto
UNA DIAGNOSI MOLECOLARE		PER L'INCONTINENTIA PIGMENTI
E' una sindrome pericolosa per le femmine, mortale per i maschi e si studia al CNR di Napoli

L'Incontinentia Pigmenti (IP) è una rara genodermatosi ereditaria legata al cromosoma sessuale X. Essa si manifesta quasi esclusivamente nelle femmine con una frequenza non molto elevata (1 su 10.000 nate vive) se si considera la popolazione generale, mentre nelle famiglie a rischio, dove vi è già stata la nascita di una donna affetta, la frequenza è pari a un concepimento su quattro, considerando anche il verificarsi di molte interruzioni spontanee di gravidanza.

fig. 1: fenotipo di incontinentia pigmenti. evoluzione delle lesioni cutanee attraverso quattro stadi tipici

Le manifestazioni cliniche e la loro gravità variano da persona a persona: neonati e bambini con Incontinentia Pigmenti spesso sviluppano lesioni vescicolose simili a varicella o herpes. Le vescicole possono diventare verrucose fino a cicatrici più o meno estese che tendono poi a regredire spontaneamente con l'età (vedi fig.1). Altri possibili sintomi sono disturbi nella prima dentizione, con denti irregolari e distanziati, alopecia, unghie parzialmente sviluppate, difetti visivi permanenti fino alla cecità, infarto e crisi epilettica. L'Incontinentia Pigmenti deve quindi essere considerata più che una patologia singola, una vera e propria sindrome, intendendo per sindrome una patologia che coinvolge diversi organi o apparati.

In collaborazione con il Consorzio Internazionale dell'Incontinentia Pigmenti, il gruppo italiano dello scrivente, ha contribuito ad individuare la causa genetica della IP nel difetto di un gene chiamato NEMO, coinvolto nel sistema cellulare di attivazione dell'NF-kB e, quindi, nella risposta infiammatoria, immunitaria ed antiapoptotica.

fig. 2: una proteina di nome nemo

In risposta allo stimolo infiammatorio NEMO si lega alle subunitā catalitiche, predisponendo il complesso ad una corretta attivitā di fosforilazione. Venendo a mancare la proteina NEMO, nelle cellule viene a mancare l'attivazione del fattore di trascrizione NFkB e quindi la risposta agli stimoli infiammatori.

L'NF-kB è una proteina che regola la trascrizione e che è presente nel citoplasma cellulare in forma inattiva in quanto è legato fisicamente ad una proteina IkB che lo rende inefficiente. In risposta a stimoli infiammatori circolanti come TNF, IL1, la proteina LPS, prodotta dai batteri patogeni, e l'RNA a doppia elica, presente durante le infezioni virali, attivano un gruppo di proteine legate insieme che va sotto il nome di complesso chinasico Ikk. Tale complesso funziona legando un gruppo fosfato all'inibitore IkB, che di conseguenza viene prontamente degradato dalla cellula liberando quindi l'NF-kB. Il fattore di trascrizione NF-kB, svincolato dal controllo negativo, è libero di trasferirsi nel nucleo dove va ad attivare i geni necessari alla cellula per la risposta allo stimolo infiammatorio (vedi fig.2). Il complesso IKK è costituito da due subunità con attività chinasica, ovvero che permettono il passaggio del gruppo fosfato: Ikkα e Ikkβ una terza subunità che serve principalmente a tenere insieme le altre due in maniera che siano attive e non interferiscano tra di loro, l'Ikkα/NEMO. Venendo a mancare la funzione della proteina NEMO, il complesso IKK non si forma, la fosforilazione di IkB non avviene, il fattore NF-kB non viene rilasciato, la risposta cellulare allo stimolo infiammatorio è interrotta.

In seguito ad uno studio eseguito su più di 50 famiglie, è emerso che la mutazione più frequente presente nell'80% dei pazienti analizzati, consiste in un riarrangiamento cromosomico nel gene NEMO che comporta la delezione di una larga porzione di questo gene. Il risultato in questo caso sarà un gene inattivo e la mancanza del prodotto del gene e della funzione biologica della proteina.

IMPORTANZA DELLA SCOPERTA

L'IP colpisce quasi esclusivamente le femmine poiché la mutazione genetica nei maschi è talmente grave che nessuno di essi sopravvive fino alla nascita. Questo accade perché le femmine possiedono due cromosomi X, di cui uno solo è mutato, mentre i maschi, che hanno un solo cromosoma X, se questo è mutato, muoiono già prima della nascita.

Nei casi in cui non è stato riscontrato il riarrangiamento cromosomico ma solo una variazione nella sequenza del gene NEMO e, quindi, una forma della proteina variante che, seppur presente, è comunque meno attiva, il quadro clinico del paziente portatore di questa mutazione è solo parzialmente sovrapponibile a quello IP. Le manifestazioni cliniche presentano quasi sempre una patologia più attenuata. È il caso, ad esempio, della Displasia Ectodermica Ipoidrotica X-linked associata ad immunodeficienza. Altri casi di displasie ectodermiche, seppure con caratteristiche genetiche e cliniche diverse, come nel caso di una displasia ectodermica ad ereditarietà autosomica dominante (MIM 129190) o recessiva (MIM 224900), sono state associate a geni codificanti per proteine coinvolte nella catena di trasduzione del segnale di NFkB. Da questo emerge l'importanza che lo studio dell'IP ha come modello per altre malattie in parte simili all'IP.

Poichè le prime manifestazioni cliniche della malattia si osservano dopo la nascita, esse possono non essere diagnosticate in periodo prenatale con accurato esame ecografico; oggi però la malattia può essere riconosciuta, come vedremo, ancor prima della nascita con lo studio molecolare.

L'identificazione del gene responsabile dell'IP e gli studi tuttora in corso di genetica molecolare su questa singolare e grave malattia hanno già portato al raggiungimento di importanti traguardi, per quanto concerne le applicazioni immediate, quali la diagnosi presintomatica anche in epoca prenatale. È stato possibile infatti mettere a punto un facile test molecolare per la diagnosi pre e post natale della malattia, che consente di riconoscere il riarrangiamento cromosomico anche disponendo di una piccola quantità di DNA estratto da un comune prelievo di sangue o dai villi coriali (vedi fig.3).

È giustificato, quindi, guardare con rinnovato ottimismo ai prossimi successi, che trovano concretizzazione attraverso una più approfondita conoscenza delle funzioni del gene.

Di qui alla progettazione di programmi di terapia genica il passo non è però breve: pur rimanendo questo il più ambito traguardo nella ricerca biologica.

RUOLO DEL CNR

La scoperta è nata dalla stretta collaborazione fra i laboratori di 5 diverse nazioni (Incontinentia Pigmenti Consortium) ed i risultati della ricerca sono stati pubblicati sulla rivista Nature: "Genomic rearrangement in Nemo impairs NF-kB activation and is a cause of Incontinentia Pigmenti" The international Incontinentia Pigmenti Consortium (per l'Italia: Esposito T., Bardaro T., Gianfrancesco F., Ciccodicola A. and D'Urso M. et al., Nature 25 maggio 2000).

La scoperta è stata fatta nel laboratorio dello scrivente, presso l'Istituto Internazionale di Genetica e Biofisica (IIGB) del CNR di Napoli, grazie al prezioso contributo dei dottori Teresa Esposito, Tiziana Bardaro, Fernando Gianfrancesco, Alfredo Ciccodicola ed all'incredibile spirito di collaborazione scientifica, che per alcuni anni, ha permesso a ricercatori italiani, inglesi, francesi, tedeschi e americani di lavorare insieme.

Questa scoperta è anche il risultato del grande impegno del gruppo napoletano, da anni coinvolto nel "Progetto Genoma Umano" presso l'IIGB-CNR di Napoli, che lo ha posto, all'avanguardia in Italia, prima nel sequenziamento del Genoma Umano, ed ora, nell'era Post-Genomica, nella determinazione della funzione dei geni.

Questi risultati sono stati ottenuti anche grazie ai finanziamenti concessi dalla Fondazione "Telethon".

Oggi il laboratorio rappresenta l'unico centro di raccolta dei pazienti affetti da Incontinentia Pigmenti dell'area mediterranea, ove è possibile effettuare la diagnosi biomolecolare pre- e post-natale della patologia.

In collaborazione con i principali centri di Dermatologia e Pediatria Immunologica italiani, i casi con diagnosi clinica, anche sospetta, di Incontinentia Pigmenti, come la Displasia Ectodermica Ipoidrotica associata ad immunodeficienza, vengono analizzati per la presenza del riarrangiamento. Sui soggetti in cui esso non è presente, viene eseguita un'analisi di mutazione per la ricerca di variazioni nel gene NEMO.

In questo modo il laboratorio napoletano rappresenta l'unico punto di riferimento in Italia per la diagnosi biomolecolare dell'Incontinentia Pigmenti e per la ricerca funzionale del gene, necessaria, questa, per una futura terapia genica.

Summary
	Familial Incontinentia Pigmenti is a genodermatosis that segregates as an X-linked dominant disorder and is usually lethal in males. In affected females it causes highly variable abnormalities of the skin, hair, nails, teeth, eyes and central nervous system. Cells expressing the mutated X chromosome are eliminated selectively around the time of birth, so females with IP exhibit extremely skewed X-inactivation. In collaboration with the International IP2 Consortium we have discovered IP mutations in a gene called NEMO (IKKgamma, NF-kB Essential MOdulator)(1). NEMO is required for the activation of the transcription factor NF-kB and is therefore central to many immune, inflammatory and apoptotic pathways.	The most common mutation diagnosed in IP patients is therefore a deletion of part of the NEMO gene. This deletion is due to chromosomal rearrangement that produce the absence of NEMO protein in the cells. Virtually all mutations that functionally eliminate NEMO and lead to uncontrolled apoptosis, cause typical skewing of X-inactivation in females and lethality in males. These results gave us the possibility to perform a simple and rapid molecular test in order to screen all patients (even in prenatal period) for the presence of the chromosomal rearrangement responsible of NEMO inactivity.